濾膜法測定總大腸菌群

    1 主題內容與適用范圍
    本方法規(guī)定了生活飲用水中總大腸菌群的濾膜測定方法。
    本方法適用于生活飲用水和低濁度的水源水中總大腸菌群數(shù)的測定。
    2 方法提要
   用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過濾水樣，**被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養(yǎng)基上，經培養(yǎng)后，計數(shù)生長在濾膜上的典型大腸菌群菌落數(shù)。
    3 培養(yǎng)基與試劑
    3.1 品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基
    3.1.1 成份
    A 蛋白胨 10g
    B 酵母浸膏 5g
    C 牛肉膏 5g
    D 乳糖 10g
    E 瓊脂 15~20g
    F 硫酸氫二鉀 3.5g
    G 無水亞硫酸鈉 5g左右
    H 堿性品紅乙醇溶液(50g/L) 20mL
    I 蒸餾水 1000mL
    3.1.2 儲存培養(yǎng)基的制備
   先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另500mL蒸餾水中加入硫酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補充蒸餾水至1000mL，混勻后調pH為7.2~7.4，再加入乳糖，分裝，115℃高壓**20min，儲存于冷暗處備用。
    3.1.3 平皿培養(yǎng)基的配制
   將上法制備的儲存培養(yǎng)基加熱融化，用**吸管按比例吸取一定量的5％堿性品紅乙醇溶液置于**空試管中，再按比例稱取所需的無水硫酸鈉置于另一**試管中，加**水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以**。
   用**吸管吸取已**的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲存培養(yǎng)基內，并充分混勻(防止產生氣泡)，立即將此種培養(yǎng)基15mL傾入已**的空平皿中。待冷卻凝固后置冰箱內備用。此種以制成的培養(yǎng)基于冰箱內保存不宜超過二周。如培養(yǎng)基已由淡粉色變?yōu)樯罴t色，則不能再用。
    3.2 乳糖蛋白胨培養(yǎng)基
    3.2.1 成份
    A 蛋白胨 10g
    B 牛肉膏 3g
    C 乳糖 5g
    D 氯化鈉 5g
    E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL
    F 蒸餾水 1000mL
    3.2.2 制法
   將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調整pH為7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，115℃高壓**20min，貯存于冷暗處備用。
    4 儀器
    4.1 濾器。
    4.2濾膜，孔徑0.45~0.65μm。直經根據(jù)濾器規(guī)格，目前常用的有3.5cm和4.7cm兩種。
    4.3 抽濾設備。
    4.4 無齒鑷子。
    4.5 培養(yǎng)箱: 36±1℃。
    4.6 冰箱: 0~4℃。
    4.7 天平。
    4.8 顯微鏡。
    4.9 平皿: 直徑為9cm。
    4.10 **刻度吸管: 1mL,10mL。
    5 檢驗步驟
    5.1 準備工作
    5.1.1 濾膜**:
   將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸**三次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次，以除去殘留溶劑。
    5.1.2 濾器**: 用點燃的酒精棉球，火焰**。也可用121℃高壓**20min。
    5.2 過濾水樣
   用無菌鑷子夾取**濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，帖放在已**的濾床上、，固定好濾器，將100mL水浴(如水樣含菌數(shù)較多，可減少過濾水樣量，或將水樣稀釋)注入濾器中，打開濾器閥門，在負0.5大氣壓下抽濾。
    5.3 培養(yǎng)
   水樣濾完后，再抽氣約5s，關上濾器閥門，取下濾器，用**鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基(36.1.3.1)上，濾膜截留**面向上，濾膜應與培養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養(yǎng)22~24h。
    6 觀察結果
    6.1 挑出符合下列特征菌落進行革蘭氏染色、鏡檢。
    紫紅色，具有金屬光澤的菌落。
    深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。
    淡紅色，中心色較深的菌落。
   6.1.1凡革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養(yǎng)基液，于37℃培養(yǎng)24h，有產酸產氣者，則判定為總大腸菌群陽性。
    6.1.2 計算濾膜上生長的總大腸菌群數(shù)，以每100mL
                                      水樣中的總大腸菌群數(shù)報告之(CFU/100mL)
   總大腸菌群菌落數(shù)(CFU/100mL)＝───────────────────────………(36－1)
                                          過濾的水樣體積(mL)