蛋白質(zhì)及肽的N末端氨基酸DNS
分析法——聚酰胺薄膜層析技術(shù)
[目的]
1．掌握聚酰胺薄膜層析技術(shù)的基本方法和應(yīng)用。
2．熟悉蛋白質(zhì)及肽的N末端氨基酸DNS分析法。
[原理]
熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，簡稱DNS-C1)在堿性條件下與氨基酸(肽或蛋白質(zhì))的氨基結(jié)合成帶有熒光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白質(zhì))，DNS-蛋白質(zhì)再經(jīng)酸水解可釋放出DNS-氨基酸，其反應(yīng)式如下：
DNS-C1能與所有的氨基酸生成具熒光的衍生物，其中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成雙DNS-氨基酸衍生物。這些衍生物相當(dāng)穩(wěn)定，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸組成的微量分析，靈敏度可達(dá)10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比過去常用的FDNB法高100倍。將Edman法和DNS法結(jié)合起來(稱為Edman-DNS法)應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的序列分析上作，可以提高Edman法的靈敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L鹽酸中105℃水解22小時(shí)，除DNS-色氨酸全部被破壞，DNS-脯氨酸(77％)，絲氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破壞外，其余DNS-氨基酸很少破壞。故DNS法可用于蛋白質(zhì)和肽的氨基酸組成N末端分析。
DNS-C1與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈基團(tuán)巰基、咪唑基、ε-氨基和酚羥基反應(yīng)，前兩者在酸堿條件下均不穩(wěn)定，酸水解時(shí)完全破壞；DNS-ε-賴氨酸和DNS-O-酪氨酸較穩(wěn)定，同時(shí)還有DNS-雙-賴氨酸和DNS-雙-酪氨酸生成，層層后在層析圖譜的位點(diǎn)上，都與DNS-α-氨基酸有區(qū)別。
DNS-C1在pH過高時(shí)，水解產(chǎn)生副產(chǎn)物DNS-OH，即：
在DNS-C1過量時(shí)，會產(chǎn)生DNS-NH2，即：
DNS-氨基酸在紫外光照射下呈現(xiàn)黃色熒光，而DNS-OH和DNS-NH2產(chǎn)生藍(lán)色熒光，可彼此區(qū)分開。
DNS-氨基酸在酸性條件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯層點(diǎn)樣 層析，這樣大量DNS-C1的反應(yīng)副產(chǎn)物DNS-OH可留于水相，干擾因素減少，所得層析圖譜清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS-谷氨酸，DNS-蘇氨酸，DNS-絲氨酸則它們大部分或部分留于水相，往往會被遺漏，而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。這時(shí)可將樣品濃縮干，用甲醇直接溶解后點(diǎn)樣，由于上述DNS-氨基酸的層析位置都位于DNS-OH的右側(cè)，影響不大，這一點(diǎn)在測定多肽或蛋白質(zhì)的N末端時(shí)要特別注意。
DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜層析法進(jìn)行分離和鑒定，在薄膜上檢測靈敏度為0.01μg(相當(dāng)于10—10mol)。聚酰胺薄膜層析是1966年后發(fā)展起來的一種新層析技術(shù)。由于它具有靈敏度高，分辨力強(qiáng)，快速，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各種化合物的分析。在用于分析測定氨基酸衍生物方面超過了過去使用的紙層析、紙電泳、硅膠薄板層析等方法。
聚酰胺是—類化學(xué)纖維原料，即錦綸(又稱尼龍)。由己二酸與己二胺聚合而成的稱錦綸66 。
因?yàn)樵谶@類物質(zhì)分子中都含有大量酰胺基團(tuán)，故統(tǒng)稱聚酰胺。它對很多極性物質(zhì)有吸附作用，這是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能與被分離物質(zhì)之間形成氫鍵。如酚類(包括黃酮類、鞣質(zhì)等)和酸類<如核苷酸、氨基酸等)是以其羥基與酰胺鍵的羰基形成氫鍵；硝基化合物和醌類等物質(zhì)與酰胺鍵的氨基形成氫鍵。被分離物質(zhì)形成氫鍵能力的強(qiáng)弱，確定吸附能力的差異。在層析過程中，層層溶劑與被分離物質(zhì)在聚酰胺表面競相形成氫鍵。因此選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑與聚酰胺表面之間的分配系數(shù)能有較大差異，經(jīng)過吸附與解吸的展層過程，可以一一分離。
聚酰胺薄膜是在滌綸片基上涂上一層錦綸薄膜制成的。
[操作方法]
1．標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的DNS化
稱取2.3μmol層析純的氨基酸(一般可將氨基酸的Mr分為100、150、200三個(gè)等級，相應(yīng)的稱量為0.23mg、0.34mg、0.46mg左右)，溶于0.5mL 0.2mol／L碳酸氫鈉溶液中。然后，取0.1ml于具塞玻璃試管中，加入0.1mLDNS-C1丙酮溶液，檢查pH，用1mol／L氫氧化鈉調(diào)pH至9.0一9.5，于室溫(20℃左右)下放置2～4小時(shí)。貯備于暗處備用。按后面所述層析溶劑系統(tǒng)，做DNS-氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜。亦可用商品標(biāo)準(zhǔn)DNS-氨基酸制作層析圖譜。
2．蛋白質(zhì)的氨基酸組成的DNS分析
取1～5nmol的蛋白質(zhì)或肽的樣品置水解管中，加0.3ml 5.7mol/L恒沸點(diǎn)鹽酸，在真空或通氮下封管，于110℃烘箱中水解18～24小時(shí)。水解后，開管，真空蒸發(fā)除去鹽酸，加少量無離子水，再蒸干，重復(fù)2～3次以除盡鹽酸。加入0.5mL 0.2mol/L碳酸氫鈉溶液，轉(zhuǎn)移到玻管中，加入0.5mLDNS-C1丙酮溶液，用l mol／L氫氧化鈉調(diào)pH至9.0～9.5，混勻，塞好，放 40℃烘箱中保溫2小時(shí)，或室溫(20℃左右)放置2～4小時(shí)。在反應(yīng)過程中樣品由黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\綠至白色。然后將玻管放置真空干燥器中蒸去丙酮。加少量水，用1 mol/L鹽酸調(diào)pH至2～3。再用乙酸乙酯抽提2～3次，每次約用0.5mL，在細(xì)長滴管中分層，將上層抽提液合并于指形管，抽去乙酸乙酯，保存于干燥器中。用前加少量丙酮溶解。按操作方法4進(jìn)行層析。對照DNS-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜(圖6-2，圖6-3，圖6-4)，便可鑒定出各種氨基酸。由此得知蛋白質(zhì)樣品的氨基酸組成。
3．蛋白質(zhì)及肽的N末端氨基酸的DNS分析
取0.2～0.5mg胰島素(或其他可供分析用的蛋白質(zhì)或肽)，置于具塞玻管中，用少量水溶解后，加入0.5mL 0.2mol/L碳酸氫鈉溶液，再加入0.5mLDNS-C1丙酮溶液，用l mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至9.0～9.5，塞好，于40℃烘箱保溫2小時(shí)，或室溫下放置2～4小時(shí)。反應(yīng)后，真空蒸去丙酮，用0.5ml5.7mol／L鹽酸移至水解管，抽真空封管。于110℃水解18-24小時(shí)，開管后蒸去鹽酸，加少量水，再蒸干，重復(fù)2-3次以除盡鹽酸，臨用前加幾滴丙酮，然后按操作方法4層析。對照胰島素N末端DNS-氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜(圖6-5)，可初步確定蛋白質(zhì)樣品的N末端氨基酸(已知胰島索A、B鏈的N末端分別為甘氨酸和苯丙氨酸)。
4．樣品的聚酰胺薄膜層析法
(1)聚酰胺薄膜的裁剪：將聚酰胺薄片裁剪成7cm×7cm方塊。在距邊0.5cm處畫互為垂直的二條基線，其交叉點(diǎn)即為點(diǎn)樣位置。如只做單向，只在一邊畫一基線，在上面每隔1 cm畫—點(diǎn)作為點(diǎn)樣位置。
(2)點(diǎn)樣：用毛細(xì)管取樣，點(diǎn)在聚酰胺薄膜點(diǎn)樣位置上，點(diǎn)子直徑不得超過2mm，若需要多次點(diǎn)樣時(shí)，應(yīng)當(dāng)將**次樣品點(diǎn)吹干后，再點(diǎn)**次。
(3)展層：將點(diǎn)完樣的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向內(nèi)，箍以線圈或膠片圈(將舊的35 mm照相底片在1 mol／L氫氧化鈉溶液中煮沸4小時(shí)，然后用水沖洗干凈，做成小箍即可用)。層層容器用小干燥器或小鐘罩(可自制，用—般試劑瓶把底去掉，將下邊磨干，塞住瓶口，放在玻璃板上即可)，內(nèi)放一小培養(yǎng)皿，倒入5-10 mL展層溶劑進(jìn)行展層，以溶劑前沿走到距邊約0.3cm為度(約10～20分鐘)，取出薄片，然后用吹風(fēng)機(jī)吹干。
展層溶劑系統(tǒng)：
①甲酸(88％)：水＝1. 5：100(V／V)。
②苯：冰乙酸＝9：1(V／V)。
⑧乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝20 ：1：1(V／V／V)。
④0.05 mol／L磷酸三鈉溶液：乙醇＝3：l(V／V)。
若只需單向?qū)游黾从孟到y(tǒng)(1)，要進(jìn)行雙向?qū)游鰰r(shí)，為了便于吹干，可先用系統(tǒng)(2)，(3)(4)為第1向，展層后取出再用系統(tǒng)(1)為第Ⅱ向，這樣可節(jié)省時(shí)間。但有時(shí)遇到聚酰胺薄膜質(zhì)地不均勻，如先用系統(tǒng)(2)展層后就有“爆皮”現(xiàn)象，無法再走第Ⅱ向。遇到這種情況仍可用系統(tǒng)(1)為第1向。但展層后因含水，需要充分吹干，*好晾過夜，次日再走第Ⅱ向。DNS-混合氨基酸層析圖譜表示于圖3-11，系統(tǒng)(2)+(3)是先做系統(tǒng)(2)，取出后在同一方向再用系統(tǒng)(3)層析，只要走1／2的距離，目的是把DNS-谷氨酸和DNS-天冬氨酸，DNS-蘇氨酸和DNS-絲氨酸， DNS-丙氨酸和DNS-NH2分開。DNS-堿性氨基酸層析圖譜表示于圖3一13，用系統(tǒng)(4)把 DNS-精氨酸，DNS-組氨酸，DNS-ε-賴氨酸分開。
(4)檢測；DNS-氨基酸用波長360 nm或280 nm的紫外燈檢測，在圖譜上除看到呈黃色熒光的DNS-氨基酸斑點(diǎn)外，還有其他顏色的雜點(diǎn)，這是囚為試劑中含少量氨和雜質(zhì)。DNS- C1試劑水解產(chǎn)物含DNS-OH，但容易區(qū)分，不影響鑒定。而DNS-NH2和DNS-丙氨酸可用系統(tǒng)(3)區(qū)別開。
[試劑]
以下試劑均用分析純(或保證試劑)，溶液要用重蒸水配制。
1．各種層析純標(biāo)準(zhǔn)氨基酸
2．樣品；胰島素或其他可供分析用的蛋白質(zhì)或肽。
3．DNS-C1丙酮溶液：配制成2.5mg／mL丙酮溶液，貯于棕色瓶中，置冰箱保存，1個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。
4．5.7mol／L重蒸鹽酸或6mol/L鹽酸
5．1 mol／L鹽酸
6．1 mol/L氫氧化鈉
7．0.2mol／L碳酸氫鈉溶液
8．苯
9．冰乙酸
10．88％甲酸
11．甲醇
12．乙酸乙酯
13．0.05mol／L磷酸三鈉溶液
14．乙醇
[器材]
1．聚酰胺薄膜：上海摩速科學(xué)器材有限公司有售021-56902220。可以反復(fù)使用，層析后用丙酮和25％～ 28％濃氨水(9：1，V／V)，或用丙酮和90％甲酸(9，1，V／V)浸泡6小時(shí)，把污物洗去，再用甲醇洗滌，晾干后可再使用。
2．小干燥器或小鐘罩
3．真空干燥器
4．具塞磨口試管(5mL)及指形樣品管
5．毛細(xì)管
6．水解管(硬質(zhì)玻璃)
7．烘箱
8．紫外分析儀
9．細(xì)長滴管
10．小培養(yǎng)皿
附：正常人血清中氨基酸的DNS化：
在有塞小試管中(內(nèi)有經(jīng)預(yù)處理的血清)加pH9.8的0，2MNaHCO30.2m1，測pH8-9，加DNS-Cl丙酮液0.2m1，充分搖勻，放入40℃溫箱保溫30分鐘，去塞后保溫15分鐘。取出后用 1 N HCl酸化至pH2-3(注意用*小體積，從一滴加起)，若酸化過份，pH<2-3?？捎?/span>1 NNaOH?；兀偌铀柡偷囊宜嵋阴?/span>l m1，搖勻。待分層，吸取上層乙酸乙酯液于另一小試管中(注意不要吸水相)，原管再加乙酸乙酯1 m1，同上搖勻分層。吸上層液于同一小試管中，80一90℃水浴蒸干后加無水乙醇50μl，搖勻后點(diǎn)樣。
正常血清DNS-氨基酸的雙向?qū)游?/span>
取一張7×7cm聚酰胺薄膜。在左下角距兩邊各0.6cm處點(diǎn)上血清DNS-氨基酸。點(diǎn)樣時(shí)，用毛細(xì)玻管吸取DNS-氨基酸無水乙醇液，點(diǎn)樣直徑控制在2-3mm之間，可重復(fù)點(diǎn)幾次以提高濃度。點(diǎn)樣量以紫外燈下能見—明亮的熒光點(diǎn)為佳。點(diǎn)樣后，將膜卷攏放在苯一冰醋酸溶液系統(tǒng)中作為**向?qū)游?/span>(點(diǎn)樣處在下，向上層析)。待溶劑前沿到達(dá)離頂端約3mm處取出。用電吹風(fēng)或電風(fēng)扇吹干，直到無冰醋酸味為止，在紫燈外下觀察層析情況。然后調(diào)轉(zhuǎn)90℃與**向垂直向再以甲酸一水作為**向?qū)游?。用電吹風(fēng)熱、冷風(fēng)交替吹干，以去除殘存溶劑，在紫外燈下觀察結(jié)果，并用鉛筆輕輕描出各熒光點(diǎn)位置。對照標(biāo)準(zhǔn)圖譜可確定各熒光點(diǎn)分別是哪種 DNS-氨基酸。 -
器材
紫外燈、40℃溫箱，電吹風(fēng)、毛細(xì)玻管、滴管、小試管、層析缸、鉛筆、直尺、pH試紙
試劑：
正常人血清預(yù)處理：取0.5ml正常人血清于離心管中，加無水乙醇1.5ml，沉淀蛋白質(zhì)(注意無水乙醇要求一滴一滴地加，且一邊加一邊搖)，置冰箱(4℃)2小時(shí)后離心，取上清液于具塞小試管中，置80-90℃蒸干備用。
(二)凝膠層析(分子篩層析)
凝膠層析是指混合物隨流動相流經(jīng)作為固定相的凝膠層析柱時(shí)，混合物中各物質(zhì)因分子大小不同而被分離的技術(shù)。凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用，故又稱為凝膠過濾或分子篩層析(gel chromatography)。
在實(shí)際操作中，把合適的凝膠顆粒裝填在層析柱內(nèi)(玻璃或塑料制品)，再把待分離的混合物自柱頂加入，然后用合適的洗脫液進(jìn)行洗脫。在洗脫過程中，混合物中各物質(zhì)主要依據(jù)分子的大小進(jìn)行層析分配，分子量大的物質(zhì)，因分子的直徑較大，不能進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，而被排阻在凝膠顆粒外部，即只分布在凝膠顆粒的間隙中，沿著這些間隙流動，這樣，它們流速較快，在洗脫液的“沖洗”下，先洗出柱外。那些分子量小的物質(zhì)，因分子的直徑較小，能夠進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，也即被滯留在凝膠顆粒內(nèi)部。在洗脫過程中，這些較小分子的洗脫行為是先在孔隙中間擴(kuò)散，然后進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，再被洗出至孔隙，再進(jìn)入顆粒內(nèi)部。如此不斷的入出和出入，直至這些物質(zhì)被洗出住外。由于洗脫的“路徑”較長，因而它們被后洗脫出來?？傊谙疵撘旱南疵撓?，混合物中分于量*大的物質(zhì)*先出柱，分子量*小的物質(zhì)*后出柱；介乎中間的物質(zhì)，則分子量愈大洗出愈快，分子量愈小洗出愈慢。這樣，不同的物質(zhì)就被分離。
葡聚糖凝膠層析過程見圖6-6。
混合物中各物質(zhì)在凝膠柱內(nèi)層析時(shí)的洗脫行為和各自的分配系數(shù)Kd有關(guān)。
Kd＝(Ve一Vo)／Vi式中；Kd為樣品組分在兩相間(凝膠顆粒內(nèi)部和外部)的分配系數(shù)，Ve為洗脫體積，即被分離物質(zhì)通過層析柱(完全洗脫出來)所需的洗脫液體積(m1)。在實(shí)際工作中，是從加樣起算，到該組分*大濃度即洗脫峰頂出現(xiàn)所需的洗脫液體積，Vo為層析柱床中溶脹凝膠顆粒間隙中液體所占的體積(m1)，即空隙的總?cè)莘e，也稱外水體積。實(shí)際工作中，可用已知被完全排阻的大分子物質(zhì)測得，如藍(lán)色葡聚糖一2000 (blue dextran 2000)，分子量為 2000kdal。Vi為層析柱中溶脹凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的總體積(mi)，也稱內(nèi)水體積，可由凝膠重量(g)相得水值Wa的乘積(即g·Wa)求得。
Kd是衡量溶質(zhì)分子被阻滯程度的一個(gè)特征性常數(shù)。某一物質(zhì)的Kd值，只要測得其Vo，就可通過上式求得。以上關(guān)系可用下圖來表示。在洗脫過程中，被洗脫成分的洗脫行為可以有三種可能的情況：
(1)Ve=Vo，表示被洗脫的某成分流經(jīng)層析柱全程所需的洗脫液體積和凝膠顆粒間隙的總體積相等。也就是說，該成分的分子全部被排阻在凝膠顆粒的間隙中，而未進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，因而洗脫速度*快，被*先洗脫出來。即該成分的Kd＝0。(圖6-7中組分a)
(Z)Vi＝Ve-Vo表示某成分被洗脫出來所需洗脫液的總體積和凝膠顆粒外部孔隙的總體積之差，等于凝膠顆粒內(nèi)部的總體積。也就是說，該成分不被排阻而可完成進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，即被滯留。因而洗脫速度*慢，被*后洗脫出來。即該成分的Kd=l。(圖6-7中組分c)
(3)Kd值介于0一l之間，大多數(shù)被分離物質(zhì)都屬于這種情況。在此范圍內(nèi)，物質(zhì)的洗脫速度隨其Kd值的增加而降低，Kd值越大，被排阻的程度越小，即被滯留的程度越大，洗脫速度越慢；反之，Kd值越小，被排阻在外的程度越大，洗脫速度越快。一般物質(zhì)的Kd值是0<Kd< l。(圖4-7中組分b)
在實(shí)際工作中，應(yīng)用較廣的是天然瓊脂糖凝膠和人工合成的交聯(lián)葡聚糖凝膠，前者的商品名為Sepharose，后者為Sephadex。
下表為葡聚糖凝膠(G)類的技術(shù)數(shù)據(jù)
