食品中總黃酮的測定

（－）目的意義

黃酮類化合物（flavonoids）是廣泛存在于植物界的一大類多酚化合物，多以苷類形式存在。其分析方法有多種，對于黃酮類化合物的相互分離以及單一成分的定量分析，常采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）；而對于總黃酮含量的測定，則主要采用分光光度法。通過本方法的學習，可以掌握食物中總黃酮的測定方法。

（二）高效液相色譜法

1. 原理  植物類樣品用石油醚脫脂后，經甲醇加熱回流提取，以高效液相色譜法分離，在紫外檢測器360nm條件下，以保留時間定性、峰面積定量。

2．儀器和試劑

（1）高效液相色譜儀

（2）紫外檢測器

（3）層析柱

（4）超聲波清洗儀

（5）索氏提取器

（6）微孔過濾器（濾膜0.45um）

（7）甲醇（色譜純）

（8）蘆丁標準品

（9）石油醚，鹽酸，磷酸（分析純）。

（10）去離子水

（11）蘆丁標準溶液：**稱取經105℃干燥恒重的蘆丁標誰品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的蘆丁標準溶液。

3. 操作步驟

（1）樣品處理

1）固體樣品：稱取2.0g干燥的固體樣品，研細，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，棄去石油醚提取液，剩余物揮去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷卻至室溫，轉移至50ml容量瓶中，甲醇定容，經0.45um濾膜過濾，供分析用。

2）液體樣品：準確吸取樣品2.0ml，直接以石油醚萃取脫脂，揮去石油醚后，以甲醇溶解并定容，經微孔濾膜（0.45um）濾過后供測定用。

（2）色譜分離條件

色譜柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;

流動相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，臨用前用超聲波脫氣；

流  速：lml／min；

柱  溫：40℃；

檢測波長：360nm；

靈敏度：0.02AUFS；

進樣量：20ul。

（3）樣品測定：準確吸取樣品處理液和標準液各10ul，注入高液相色譜儀進行分離，以其標準溶液峰的保留時間定性，以其峰面積計算出樣品中總黃酮的含量。

4．結果計算

（三）分光光度法

1．原理  黃酮類化合物是具有苯并吡喃環(huán)結構的一類天然化合物的總稱，一般都具有4位羰基，且呈現(xiàn)黃色。黃酮類化合物的3—羥基、4—羥基或5—羥基、4－羰基或鄰二位酚羥基，與鋁鹽進行絡合反應，在堿性條件下生成紅色的絡合物。

本方法對樣品中黃酮類化合物進行提取純化后，用分光光度法于510nm波長下測定其吸光度，與蘆丁標準品比較，進行待測物中總黃酮的定量測定。

2．儀器和試劑

（1）722分光光度計

（2）索氏提取器

（3）真空泵，鹽基交換管等。

（4）恒溫水浴，分液漏斗。

（5）蘆丁標準品

（6）亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉（分析純）。

（7）氯仿，無水乙醇，甲醇（分析純）。

（8）5％香草醛溶液：稱取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。

（9）聚酰胺樹脂

（10）去離子水

（11）同前

3．操作步驟

（1）樣品處理

1）固體樣品：稱取1～2g干燥的固體樣品，用濾紙包緊，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸潤后，在80℃水浴下回流3h，至提取液無色為止。粗提液冷卻后，減壓抽濾，并用少量25％乙醇溶液洗滌濾渣，合并濾液。在50℃下減壓蒸餾，除去其中的乙醇，直至索氏提取器內溶液呈無醇味。倒出容器內溶液，用30ml熱水分3次洗滌，抽濾后，將濾液倒入分液漏斗中，以75ml氯仿分3次萃取脫脂，待完全分層后，收集各次下層水溶液并定容至50ml。

稱取1～2g經預處理的層析聚酰胺樹脂粉末(上海摩速公司生產)，濕法裝柱，用水飽和。吸取上述脫脂后的水溶液1～2ml，沿層析柱漫漫滴人柱內，放置一定時間，待測液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脫，流速為1.0ml／min，至流出液基本無色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脫劑定容后即可用于測定。

2）液體樣品：準確吸取1.0ml樣品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脫脂，其余步驟同上。

（2）標準曲線的繪制：準確吸取蘆丁標準溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相當于蘆丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亞硝酸鈉溶液0.3ml，振搖后放置5min，加入10％硝酸鋁溶液0.3ml搖勻后放置6min，加1.0mol／L氫氧化鈉溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。搖勻，放置15min，于510nm波長處測定吸光度，以零管為空白，以蘆丁含量（ug）為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，計算相關系數(shù)（r）。

（3）樣品測定：根據(jù)樣品中總黃酮含量高低，取適宜體積待測液，按標準曲線制備操作步驟于510nm處進行吸光度的測定（樣液如有沉淀，應過濾后測定）。

4.結果計算  根據(jù)標準工作曲線，求出相當于樣品吸光度的蘆丁含量，按下式求出總黃酮含量：

（四）說明

1．HPLC法與分光光度法比較，HPLC法相對干擾少，重現(xiàn)性好，測定結果更為準確可靠；但其操作較為煩瑣，費用較高。分光光度法操作簡便、快速、易行，所需費用不高；但易受雜質干擾，穩(wěn)定性稍差。

2．樣品水解后隨著放置時間的延長，總黃酮的含量可能會發(fā)生變化，因此樣品水解后應盡快測定。

3. 隨著顯色時間的延長，吸光度將略有下降，因此應盡快進行測定。